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 | Sujet: TD 04 de microbiologie Oran IGMO: Etude macroscopique et microscopiques des bactéries  Mer 18 Fév 2015 - 23:27 | |
| Par Messaoui Naima
EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES
L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de l'isolement après incubation. L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé de la durée et de la température de l'incubation.
Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées.
La colonie peut apparaître à la surface du milieu de culture pour les germes aérobies, ou être en profondeur pour les germes anaérobies
I. Aspect de colonies en surface sur milieu solide
1.1. La taille
Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies. Il est possible aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour mesurer la taille des petites colonies en utilisant de micromètres oculaires..
1.2. La forme
Allure de contours : lisse, dentelés, déchiquetés, irréguliers
Relief : surface bombée, demi-bombée, plate.
Centre : parfois surélève, parfois ombiliquée (en creux)
1.3. L'aspect de la surface
La surface d’une colonie bactérienne peut être lisse, rugueux, renvoyer la lumière de façon à leur donner un reflet métallique ou un aspect irisé.
1.4. L'opacité
Les colonies sont décrites comme :
Opaques (ne laissent pas passer la lumière)
Translucides (laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, comme le verre dépoli)
Transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers, comme le verre, on parle de gouttes de rosée"
1.5. La consistance
Au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses (on obtient facilement des suspensions homogènes), sèches ou encore muqueuses (on obtient difficilement des suspensions homogènes).
1.6. La couleur et/ou pigment
Plusieurs colonies n’ont pas une couleur bien définie (blanc, gris). Par contre, certaines bactéries produisent un pigment insoluble qui donnent un aspect bien caractéristique à la colonie (rose, jaune, rouge …), tendis que d’autres produisent un pigment soluble qui diffuse et colore le milieu.
2. Aspect des colonies en profondeur :
a) Colonies régulières en formes de lentilles,
b) Colonies irrégulières de formes diffuses et floues.
3. Aspect des colonies en surface sur gélose linéaire
a) filiformes
b) légèrement envahissantes avec bords ondulés
c) légèrement envahissantes avec bord érodé
d) envahissante
Les formes des colonies en observation macroscopique
II. Aspect de la pousse en milieu liquide
Les bouillons nutritifs sont aussi utilisés pour cultiver les bactéries. Dans un bouillon la croissance microbienne se traduit par l’apparition d’un trouble ou opalescence mais l’aspect varie selon les espèces.
L’EXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES
L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules d’une espèce bactérienne. Elle comprend :
I. Examen à l’état frais
C’est l’examen microscopique de bactéries vivantes, en milieu liquide. Il permet d’apprécier leur mobilité (ou immobilité) et leur morphologie.
II. EXAMEN APRÈS COLORATION
L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une lame et ayant subi l’action d’un ou plusieurs colorants. Les colorations, réalisées sur des frottis, sèches et fixes, sont classées en :
o Coloration simple (un seul colorant)
o Coloration différentielle type Gram
o Colorations spéciales des structures bactériennes (capsules, spors….).
REMARQUE :
La réalisation de frottis de bonne qualité est une condition préalable à toute coloration.
1. Réalisation des frottis :
Les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés et fixés.
[list]
-Etalement sur lame de verre :
-Notez la référence de l’échantillon sur une lame parfaitement propres et dégraissées, 2. Prélevez stérilement à l’aide d’une anse de platine une goutte de culture bactérienne et étalez un film mince,
-Séchage :
Le séchage est effectué à l’aire libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect mat.
-Fixation du frottis sec :
Cette étape consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans en altérer la structure. La fixation s’effectue par la chaleur :
-La lame, tenue par une pince (frottis situé sur le dessus) est passée 3ou 4 fois dans
la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant d’entreprendre une coloration.
-Fixé le frottis en passant délicatement et rapidement la lame 2-3 fois au-dessus de la flamme
I. COLORATIONS SIMPLES : (Coloration au bleu de Méthylène)
La coloration au bleu de méthylène peut apporter des informations concernant la morphologie des germes.
Mode opératoire :
Sur le frottis fixé et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de méthylène phéniqué jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.
- Laisser agir 1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée, ou à l'eau du
robinet jusqu'à élimination des colorants en excès.
- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou encore sécher délicatement entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif à immersion.
Résultats
Les bactéries sont colorées en bleu sombre. Cette coloration est intéressante pour l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'étude de la morphologie des bactéries.
II. COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM
C’est la coloration de base en bactériologie qui permet de distinguer les bactéries en Gram positif et en Gram négatif, cette distinction est fondamentale pour leur identification. En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.
Réactifs :
- Violet de gentiane phénique
- Lugol (iodo-iodure de potassium)
- Alcool à 95% (ou mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone)
- Safranine (ou Fuchsine phéniquée de ziehl)
Mode opératoire :
1. Réaliser un frottis et le fixer à la flamme
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute
3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol ; laisser agir le Lugol environ 1 min
4. Jeter le Lugol et faire couler de l’alcool sur la préparation ; rincer immédiatement à l’eau
5. Recouvrir la préparation de Safranine, laisser agir environ 1 min. laver abondamment.
6. Sécher au-dessus de la flamme d’un bec Bunsen.
Résultats:
A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
- Des bactéries colorées en violet foncé ; elles ont gardé le violet, ‘le gram’ elle sont ddites ‘Gram positif’ ;
- Des bactéries colorées en rose ou rouge pâle ; elles ont perdu le violet, ‘le Gram’ elles sont dites ‘gram négatif’.
Différence entre bactéries Gram+ et bactéries Gram-
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fatima31
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| | Sujet: Re: TD 04 de microbiologie Oran IGMO: Etude macroscopique et microscopiques des bactéries Jeu 19 Fév 2015 - 20:47 | |
| Merci bcp  | |
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